Co to jest reakcja łańcuchowa polimerazy (pcr)? fakty na temat testu, kroków i używane do

Co to jest PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy)?

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest techniką stosowaną do amplifikacji śladowych ilości DNA (aw niektórych przypadkach RNA) znajdujących się w lub na prawie dowolnej cieczy lub powierzchni, na której można osadzić nici DNA. Kluczem do zrozumienia PCR jest wiedza, że ​​każdy człowiek, zwierzę, roślina, pasożyt, bakteria lub wirus zawiera materiał genetyczny, taki jak sekwencje DNA (lub RNA) (sekwencje nukleotydowe lub fragmenty DNA lub RNA), które są unikalne dla ich gatunku, i poszczególnym członkom tego gatunku. W konsekwencji, jeśli próbka zawiera segmenty DNA lub RNA, PCR jest metodą stosowaną do amplifikacji (tworzenia o wiele więcej identycznych kopii) tych unikalnych sekwencji, dzięki czemu można je następnie z bardzo dużym prawdopodobieństwem ustalić tożsamość źródła (a konkretna osoba, zwierzę lub organizm chorobotwórczy) śladowego DNA lub RNA znalezionego w lub na prawie każdej próbce materiału.

Amplifikacja PCR jest jednak tylko częścią testu identyfikującego. Po zakończeniu amplifikacji (patrz poniżej), amplifikowane segmenty należy porównać z innymi segmentami nukleotydowymi ze znanego źródła (na przykład konkretnej osoby, zwierzęcia lub organizmu patogennego). To porównanie unikalnych segmentów jest często wykonywane przez umieszczenie generowanych przez PCR sekwencji nukleotydowych obok znanych sekwencji nukleotydowych od ludzi, patogenów lub innych źródeł w żelu rozdzielającym. Prąd elektryczny przepływa przez żel, a różne sekwencje nukleotydowe tworzą pasma, które przypominają „drabinę” zgodnie z ich ładunkiem elektrycznym i wielkością cząsteczki. Jest to nazywane elektroforezą żelową. Pasma lub „drabinowe” etapy, które migrują do tych samych poziomów w żelu, wykazują identyczność sekwencji nukleotydowych. Ta metoda jest jednym z najpopularniejszych sposobów przeprowadzania testów PCR (patrz ryc. 1).

Ryc. 1, prążki lub „drabinkowe” etapy wytworzonego przez PCR DNA Mycobacterium (dzięki uprzejmości CDC)

Postać. Wzory powtarzalnego elementu (Rep) –PCR (A) i elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE) (B) izolatów Mycobacteriumosmetum od 2 pacjentów w Ohio i 1 pacjenta w Wenezueli. Rep-PCR przeprowadzono stosując starter BOXA1R (3), a PFGE przeprowadzono enzymem restrykcyjnym AseI. Ścieżki 1, 2, Ohio izolują OH1 i OH2; ścieżki 3, 4, szczepy kontrolne ATCC BAA-878T i ATCC BAA-879; ścieżka 5, wenezuelski izolat VZ1. Standardami wielkości DNA są 100 bp (S1) i marker 48, 5 kb (S2).

Jak odbywa się PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy)?

W 1983 r. Kary Mullis opracował podstawowe kroki do amplifikacji sekwencji DNA. Wraz z Michaelem Smithem zostali nagrodzeni Nagrodą Nobla za opracowanie tej procedury w 1993 r. Jest kilka podstawowych kroków, które należy wykonać kolejno; PCR można wykonać w jednej probówce z odpowiednimi chemikaliami i specjalnie zaprojektowanym grzejnikiem. Potrzebne odczynniki lub chemikalia są następujące:

• Próbka zawierająca sekwencję nukleotydową (z krwi, włosów, ropy, skrobania skóry itp.)
• Startery DNA: krótki jednoniciowy DNA, który przyczepia się do sekwencji nukleotydowych, który promuje syntezę komplementarnej nici nukleotydów
• Polimeraza DNA: enzym, który, gdy DNA wiąże się ze starterem, schodzi w dół segmentu DNA, łącząc bloki budulcowe DNA, tworząc komplementarne pary zasad, a tym samym syntetyzuje komplementarną nić nukleotydową DNA (wprowadzenie odpornej na ciepło polimerazy DNA, Taq polimeraza pochodząca z bakterii odpornych na ciepło, znacznie poprawiła zdolność do przeprowadzania PCR)
• W roztworze występuje duży nadmiar bloków budulcowych DNA zwanych nukleotydami (adenina, tymidyna, cytozyna i guanina, w skrócie odpowiednio: A, T, C i G). Gdy bloki te są ze sobą połączone, tworzą sekwencję nukleotydową lub pojedynczą nić DNA. Gdy te bloki budulcowe wiążą się z komplementarnym blokiem budulcowym przez słabe wiązania wodorowe (na przykład A wiąże się tylko z T i G tylko z C), powstaje komplementarna sekwencja nukleotydowa DNA i wiąże się z oryginalnym jednoniciowym DNA. Po zakończeniu wiązania powstaje komplementarny dwuniciowy DNA w określonej sekwencji.

PCR rozpoczyna się zatem od fragmentu DNA z próbki umieszczonej w probówce z odczynnikami wymienionymi powyżej. Roztwór ogrzewa się do co najmniej 94 ° C (201, 2 F); to ciepło przerywa wiązania wodorowe, które pozwalają na tworzenie komplementarnych nici DNA, więc w mieszaninie występują tylko pojedyncze nici (jest to określane jako denaturacja dwuniciowego DNA).

Mieszaninę pozostawia się do ochłodzenia do około 54 ° C (129, 2 F). W tej temperaturze startery DNA i polimeraza DNA wiążą się z pojedynczym jednoniciowym DNA (jest to nazywane wyżarzaniem DNA). Ponieważ bloki budulcowe są nadmierne (wysokie stężenie) w mieszaninie, polimeraza wykorzystuje je do tworzenia nowych komplementarnych nici DNA (zwanych przedłużeniem DNA), a proces ten przebiega szybciej w temperaturze 72 ° C (161, 6 F). Ten proces tworzy nową dwuniciową cząsteczkę DNA z każdej z pojedynczych nici oryginalnej cząsteczki.

Cykl ten powtarza się około 40 razy w urządzeniu nazywanym termocyklerem, który automatycznie powtarza cykle grzania-chłodzenia, przy czym ilość każdej sekwencji DNA podwaja się po każdym zakończeniu cyklu grzania-chłodzenia. To, co początkowo było pojedynczym krótkim segmentem DNA, można amplifikować do około 100 miliardów kopii po 40 podwójnych cyklach.

Dlaczego lekarz zleca test PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy)?

Test PCR stanowi podstawę szeregu testów, które mogą odpowiedzieć na wiele różnych pytań medycznych, które pomagają lekarzom diagnozować i leczyć pacjentów. Na przykład testy PCR mogą wykryć i zidentyfikować patogenne organizmy u pacjentów, szczególnie tych, które są trudne do hodowli (na przykład HIV i inne wirusy i niektóre grzyby).

Inni lekarze zlecają testy PCR, aby pomóc zdiagnozować choroby genetyczne, podczas gdy inni lekarze używają PCR do wykrywania związków biologicznych, takich jak identyfikacja rodziców dzieci. Testy PCR są również wykorzystywane do identyfikacji i charakteryzacji mutacji genetycznych i rearanżacji w niektórych nowotworach.

Jednak testy PCR zostały zmodyfikowane i rozszerzone na wiele aspektów badań naukowych, w tym na biologię ewolucyjną, genetyczne pobieranie odcisków palców, badania kryminalistyczne i wiele innych.

Co to jest RT-PCR?

RT-PCR to test PCR przeznaczony do wykrywania i pomiaru RNA. Chociaż wstępne testy PCR zamplifikowały DNA, wiele wirusów i innych składników biologicznych (na przykład mitochondria) wykorzystuje RNA jako materiał genetyczny. RT-PCR różni się od konwencjonalnej PCR, najpierw pobierając RNA i przekształcając nić RNA w nić DNA. Odbywa się to zasadniczo tą samą metodą PCR opisaną powyżej, z wyjątkiem zastosowania enzymu zwanego odwrotną transkryptazą zamiast polimerazy DNA. Odwrotna transkryptaza pozwala na translację pojedynczej nici RNA na komplementarną nić DNA. Po wystąpieniu tej reakcji można zastosować rutynową metodę PCR do amplifikacji DNA. RT-PCR zastosowano do wykrywania i badania wielu wirusów RNA.

RT-PCR nie należy mylić z inną odmianą PCR, zwaną PCR w czasie rzeczywistym. PCR w czasie rzeczywistym jest odmianą PCR, która umożliwia analizę zamplifikowanego DNA podczas zwykłych 40 cykli procedury. Chociaż procedura jest podobna do konwencjonalnej PCR z cyklem, PCR w czasie rzeczywistym wykorzystuje barwniki fluorescencyjne przyłączone do niektórych bloków budulcowych lub małych nici nukleotydowych. W zależności od zastosowanej metody fluorescencja występuje, gdy powstają zamplifikowane nici DNA. Ilość fluorescencji można zmierzyć podczas 40 cykli i umożliwia badaczom pomiar określonych produktów i ich ilości podczas cykli amplifikacji. Często pozwala to badaczom lub technikom laboratoryjnym na pominięcie elektroforezy żelowej lub innych wtórnych procedur potrzebnych do analizy produktów PCR, co daje szybsze wyniki.

PCR w czasie rzeczywistym i RT-PCR są odmianami lub modyfikacjami oryginalnego testu PCR. Istnieje jednak wiele innych odmian (co najmniej 25), które służą rozwiązaniu określonych problemów. Wszystkie mają różne nazwy, takie jak PCR z zestawu, PCR z gorącym startem, PCR z multipleksem, PCR w fazie stałej i wiele innych.

PCR prawdopodobnie będzie nadal modyfikowany, aby pomóc odpowiedzieć na wszelkie inne pytania w medycynie, biologii. i inne kierunki studiów.